国产mRNA新冠疫苗研发需要突破哪些技术壁垒？

• 2022-05-21 05:35:08 来源：新浪医药新闻

文 | 九思

导读：mRNA（信使核糖核酸）技术作为一种极具潜力的通用技术平台，可以用于传染病的预防、肿瘤免疫治疗、蛋白替代、CAR-T、基因编辑等，总体可以分为三大类：预防疫苗、治疗医疗、治疗药物。辉瑞/BioNTech合作开发的Comirnaty和Moderna开发的Spikevax，2020年12月相继获得FDA紧急使用授权用于预防由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) 引起的COVID-19。2021年Comirnaty和Spikevax的销售额分别达到了368亿美元和177亿美元，两款疫苗在全球防疫中大放异彩，这也预示着mRNA技术正式进入商业化时代。我国的mRNA技术行业也开始蓬勃发展，目前石药、康希诺针对突变株的mRNA疫苗今年4月份已获批临床。下面我们来盘点一下mRNA疫苗研发的技术壁垒和市场前景。

mRNA由DNA模板转录而来，携带遗传信息，指导细胞生产胞内蛋白、膜蛋白及胞外蛋白。以mRNA疫苗为例，核心原理就是将编码的mRNA通过不同的方式递送到人体细胞内，在细胞内翻译后产生相应的抗原蛋白，从而有效激起细胞免疫和体液免疫。递送的mRNA通过内吞作用进入细胞，并在体内释放后，通过核糖体翻译成蛋白质。

翻译的蛋白质可以通过两种方式激活免疫系统：蛋白质被蛋白酶降解为肽，随后通过主要相容性复合物MHC I类分子与T细胞受体（TCR）结合作为抗原呈递在细胞表面，通过激活CD8+ T细胞，它可以通过分泌细胞因子来激活细胞免疫反应，也可以通过共激活B细胞来激活体液免疫反应。此外，在mRNA疫苗中递送的单链RNA和双链RNA通过与体内的Toll样受体（TLR）结合，产生I型干扰素（IFN-I）导致了几种IFN-1刺激基因的诱导，激活抗病毒先天免疫反应。

图1 mRNA疫苗的作用机理

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mRNA技术的发展历程

分子修饰、递送等关键技术实现突破，为商业化时代开启奠定了基础。mRNA从首次发现到作为商品销售大概经历了60年，技术的发展经历了以下几个阶段。

（1）1961-1990年：mRNA从理论照进现实。从1961年mRNA的发现，到1990年全球首次发表小鼠体内体外转录mRNA的报告，明确了mRNA的具体机制和作用以及其发展潜力。

（2）1990-2009年：分子修饰等关键技术使得人体应用成为可能。从上世纪90年代到2009年，mRNA技术实现了从动物到人体的突破，2005年发现化学修饰可降低mRNA免疫原性，2009年首次在人体上应用癌症免疫治疗。

（3）2009-2022年：递送技术的发展推动人体临床大规模开展。2009年脂质纳米颗粒（LNP）递送系统首次申请专利，2010年全球mRNA领导者Moderna成立。2015年首个LNP递送技术以及序列修饰技术的逐渐成熟，给mRNA行业发展带来充足的动力，多项mRNA疫苗开展临床。

（4）2020年-至今：商业化时代正式开启，2020年全球首个mRNA商业化产品上市，迅速得到资本市场的追捧。

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mRNA疫苗的生产过程和成本构成

mRNA疫苗的生产主要包括靶抗原序列设计、质粒构建、建立三级细菌生物库，DNA模板制备、mRNA的体外转录、mRNA的纯化、LNP组装和封装、mRNA-LNP复合物稀释、mRNA-LNP复合物浓缩、无菌过滤和罐装等，生产过程涉及到分子结构设计、递送系统的优化，生产工艺放大等诸多环节，每个环节都有一些技术壁垒或者工艺难点需要解决，由于mRNA分子的脆弱性，目前尚未完全实现裸露mRNA药物注射进人体从而发挥作用，因此找到合适的递送系统便成为最关键的部分。另外，找到合适的递送系统后，让mRNA的翻译效率最高则需要序列优化，同时摸索将实验室中试工艺放大并稳定生产需要的工艺参数，从而形成稳定的供货体系。

图2 mRNA疫苗的生产过程

已上市的两款mRNA新冠疫苗，单剂售价大约在15-20美元左右（不同地区可能会有差异），毛利率85%左右，则生产成本大约在1-3美元。其中原材料占比（41.7%-55.9%）最高，其次是设备/耗材（23.9%-31.7%）。在原材料中，帽子类似物占比46%，工具酶（包括T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、RNA抑制酶）占比29%、核苷酸/修饰核苷酸占比7%、DNA模板占比4%、LNP四种组分占比5%，其他原材料占比10%。

表1 mRNA疫苗生产成本拆分

（亿美元，8亿剂）

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mRNA疫苗研发关键壁垒：

递送系统、序列优化、生产工艺

➣递送系统：专利保护和工艺参数铸就递送系统的高壁垒

mRNA的脆弱性使得递送系统成为关键。mRNA指导细胞生产自身所需蛋白质，靶点可在细胞内或分泌到细胞外，因此理论上可将编码相应蛋白质的mRNA通过一定手段运送到细胞质内，从而对所有蛋白质层面疾病发挥疗效。但是由于其大小、电荷和可降解性，裸露的mRNA不容易穿过细胞膜并有效渗入到细胞质，因此如何将mRNA递送至细胞质中并及时指导蛋白质生产将成为核心。

目前mRNA递送主要面临3个难点，如胞外屏障、内体逃逸、包内免疫，一个优异的递送系统需要解决以上3个难点。目前已有脂质/类脂、聚合物、多肽、蛋白质、胞外囊泡等材料用于递送系统，其中脂质/类脂、聚合物最为常见。进入临床的递送系统主要有脂质体、LNP、脂质复合物、脂质多聚复合物（LPP）,其中LNP最为常见。目前Monerna、BioNTech、CureVac以及国内除斯微生物的多数mRNA公司的递送系统均使用LNP。

LNP主要是由阳离子脂质、中性脂质、PEG修饰脂质、胆固醇等构成，不同分子及构成比例是各种LNP系统的主要差异所在。

阳离子脂质：具有pH敏感性，与带负电的mRNA结合，可高效包载核酸药物，同时在酸性环境下被质子化，有助于内涵体逃逸。

中性脂质：稳定粒子，破坏内涵体稳定性提高核酸递送效率。

PEG修饰脂质：提高粒子稳定性，减少粒子在体内与血浆蛋白的结合，延长体循环时间。

胆固醇：稳定LNP结构，调节膜流动性，提高粒子稳定性。

图3 LNP结构示意图

表2 不同公司LNP组分构成

尽管BioNTech和Moderna的mRNA疫苗都使用了LNP递送系统，但是两家公司或多或少都面临着专利纠纷。目前Arbutus具有LNP递送系统的专利所有权（US8058069B2），其专利范围包含核酸、阳离子脂质，非阳离子脂质、缀合脂质以及各成分的比例，专利预期2029年到期。

表3 LNP递送系统的专利范围

虽然LNP递送系统的组分配方已经公开，但是大量的工艺参数依然是商业秘密，这也意味着即使企业知道如何使用合适比例的原料进行LNP的配制，LNP粒径是否均一，杂质是否有残留、阳离子脂质导致的细胞毒性、LNP的靶向性以及如何可控的释放包封药物等也会影响工艺参数的稳定性。

➣序列优化：分子修饰专利和高效率加帽构成较大难度

mRNA的基因序列一般由5’-cap（5’端帽子）、5‘UTR（5’端非编码区）、ORF（编码区）、3’UTR（3‘端非编码区）以及Poly（A）tail（多聚腺苷酸尾）组成。通过对mRNA分子序列优化，提高mRNA分子稳定性、翻译效率、表达量、半衰期等，从而进一步增加mRNA疫苗的安全性和有效性。2021年6月CureVac宣布其开发的mRNA疫苗CVnCoV在2b/3期临床试验中预防感染COVID-19仅有47%的保护力，可能失败的原因包括未对编码区的核苷酸进行修饰。

图4 mRNA的结构和核苷酸修饰

5’-cap（5’端帽子）：在真核生物中可以与翻译起始因子elF4E结合，保持mRNA的稳定，提高翻译效率，同时抑制外切核酸酶对mRNA的降解并抑制固有免疫反应。

5‘UTR（5’端非编码区）：调控翻译和蛋白表达，对mRNA的翻译效率、半衰期、蛋白表达水平等有影响。一般可以引入Kozak序列或者保持短散的设计从而增强翻译效率。

ORF（编码区）：3个碱基组成的密码子可以翻译成氨基酸，之后形成肽链后结构化成蛋白质。通过密码子的优化（规避不常见/不安全组合）、核苷酸替换（使用假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺苷等修饰核苷酸）等增强mRNA的稳定性和翻译效率、同时减少固有免疫和mRNA的降解。

3’UTR（3‘端非编码区）：调控翻译和蛋白表达，对mRNA的翻译效率、半衰期、蛋白表达水平等有影响。一般可以引入稳定元件（人类α-珠蛋白/β-珠蛋白）来增强mRNA稳定性、增强翻译效率。

Poly（A）tail(多聚腺苷酸尾)：抑制mRNA脱帽和降解，尾巴长度影响翻译效率和蛋白表达水平。一般而言，64-150 nt长度的Poly（A）能够实现最高水平的蛋白表达。加尾途径一般有两种：模板加入Poly（A），转录后Poly（A）修饰。

已经上市的两款mRNA疫苗均对mRNA的分子序列、结构等进行了设计和优化。分子修饰的关键专利（US8278036B2）所有权属于宾大，预计2025年到期，通过两次授权给BioNTech和Moderna，该专利范围极广，包括（a）假尿嘧啶、（b）Poly(A)尾、(c)m7GpppG帽/3’-O-甲基-m7GpppG帽、（d）不依赖帽的翻译增强子、（e）增强翻译的5’和3’非翻译区，其中假尿苷修饰最为关键。目前该专利基本上都绕不开，需要购买该专利或者开发更为合适的分子修饰策略，但难度极大。在不考虑专利壁垒的情况下，体外转录合成mRNA分子最关键的环节在于如何高效率加帽。加帽途径一般有两种：一步法（共转录加帽）、两步法（转录后加帽）。其中BioNTech用到的就是共转录加帽，Moderna利用的则是转录后加帽。

表4 两种加帽途径的对比

➣生产工艺：将mRNA更好地搭载到递送载体上是关键

在mRNA疫苗的生产过程中，将含有脂质的乙醇相和含有mRNA的水相混合后形成脂质超饱和状态，在毫秒级时间里自组装成纳米颗粒。最关键的工艺环节是将mRNA包裹在LNP中，从而形成稳定的纳米颗粒。目前可通过微流控、射流等方式实现这一过程，然而各家公司的工艺参数依然是商业秘密，所以无论选择 Y 型微流控、T 型微流控还是冲击射流都需要在实际生产中不断摸索具体的工艺参数，形成可用于规模放大的稳定工艺体系。

mRNA-LNP 组装流程

mRNA疫苗生产中，将含有脂质的乙醇相和含有mRNA的水相混合后形成脂质超饱和状态，主要过程如下：

利用微流控技术（Y型或T型），将含有脂质的乙醇和含有mRNA的水相在pH=4的缓冲液中快速混合；

当可离子脂质与水相相遇时，调节pH=5.5（介于缓冲液pKa和可电离脂质的pKa之间），可离子脂质发生质子化形成阳离子脂质；

阳离子脂质与mRNA的阴离子磷酸骨架静电结合，同时它在水相中具有疏水性，驱动囊泡的形成和mRNA的包裹；

提高pH=7.4，中和阳离子脂质，使其疏水性增强，从而驱动囊泡融合，完成脂质纳米颗粒的进一步包裹。

纯化工艺贯穿整个流程，高效的优化策略至关重要

mRNA 疫苗生产过程中会产生很多杂质，无论是在质粒生产、纯化与线性过程中，还是在体外转录、加帽等过程中，均会涉及到多步纯化与超滤，如何保证上一步工艺不影响下一步工艺尤为重要，同时需要保证mRNA和递送系统的稳定性。

除了组装工艺、纯化工艺之外，在大规模生产中LNP粒径均一、杂质残留等工艺也需要不断完善。同时，如何在保持组分活性不下降的情况下，更高效的冷冻/干燥从而保持更长时间的稳定性也是非常重要的生产工艺课题。

图5 mRNA疫苗纯化工艺生产流程示意图

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市场前景

根据PubMed预计，2035年mRNA市场总体规模在230亿美元，其中非新冠产品有望达到180亿美元，2025-2035复合年均增长率（GAGR）达到68%。预防疫苗2035年市场规模在120-150亿美元，其中新冠疫苗预计贡献50亿美元。其他疫苗预计2024-2025年开始进入市场销售，随着市场的开拓和放量，假设平均每个在研管线峰值为8亿美元，预计2035年销售额将达到70-100亿美元。假设个性化肿瘤疫苗的销售峰值为50亿美元，单一肿瘤疫苗的销售峰值为13亿美元，治疗疫苗2035年市场规模将达到70-100亿美元，PubMed还预计治疗药物市场规模将达到40-50亿美元。

总之，在 COVID-19 爆发之前，mRNA技术主要用于开发新的癌症治疗药物，COVID-19大流行促进了mRNA 疫苗平台的发展，与传统疫苗相比开发周期快、无需细胞培养、免疫原性高， 但是充满着挑战。mRNA疫苗研发需要突破递送系统、序列优化、生产工艺具体参数等高技术壁垒。mRNA技术商业化时代已经开启是不争的事实，在旺盛的需求下mRNA技术有望进入快速发展的黄金十年。

参考资料：

1.Advances in COVID-19 mRNA vaccine development. doi: 10.1038/s41392-022-00950-y.

2.中泰证券

标签： 工艺参数 生产工艺 体外转录

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